李翠莲 杨跃煌 胡双林

(昆明市儿童医院, 云南昆明 650034)

第一作者：李翠莲，女，彝族，硕士研究生，研究方向：小儿血液系统疾病。

通讯作者：杨跃煌，男，主任医师，硕士研究生导师。云南省昆明市儿童医院。邮编650034.



[摘要] 目的　探讨云南昆明市地中海贫血的基因突变类型，分析基因突变类型与临床病情的关系。方法　用多重聚合酶链反应检测α-地中海贫血，PCR/反向斑点杂交法（PCR/RDB）检测β-地中海贫血。结果　确诊地中海贫血41例，共检出9种基因突变类型17种组合。其中6例为α-地中海贫血，34例为β-地中海贫血，1例为α复合β地中海贫血。 结论　本地区地中海贫血基因突变类型较复杂，α-地中海贫血以东南亚缺失型(-SEA)为主，β-地中海贫血以17位点突变发病率最高，此结果有别于其他地区文献报道，提示云南地中海贫血发病有其自身特点，有价值开展进一步的研究。不同的基因类型致临床表现不同，HbH 病、α复合β地中海贫血、β地贫纯合子以及双重杂合子临床表现均较严重,发病较早；β地贫杂合子以及单一缺失型α-地贫贫血相对较轻，发病年龄及输血年龄均较晚。

[关键词] 地中海贫血；基因诊断；临床表现



Analysis of genotypes and clinical manifestations of 41 cases with Thalassemia

LI Cuilian , YANG Yue-huang, HU Shuang-lin(Children's hospital of kunming , kunming 650034,China

[Abstract] Objective To inquire into the type of gene mutation of thalassemia in Kunming city , Yunnan province, and analyze the relationship between gene mutation and clinical manifestations. Methods Ploymerase Chain Reaction was used to test the type of gene mutation of α- thalassemia,. and Reverse Dot Blot (RDB) was used to the β- thalassemia. Results According to gene analysis,41 cases were final diagnosed , there were 9 types of gene mutation with 17 gene combinations.Among the total, 6 cases were gene deficiency α- thalassemia, and 34 cases were gene deficiency β- thalassemia, there was 1 case both α- thalassemia and β- thalassemia. Conclusion The type of gene mutation of thalassemia is very complicated in the city, the main type of α- thalassemia is – –SEA/αα , the highest incidence of gene mutation of β- thalassemia is 17 site, this result is different from the literature of other areas, it signifies that the thalassemia invasion of Yunnan has its characters, it is valuable to launch further research. Different genotypes result in different clinical presentation, HbH disease, α- thalassemia and β- thalassemia in one case, the homozygote and double heterozygote of β- thalassemia had severe clinical course, earlier onset; the heterozygote of β- thalassemia and single deletion form of α- thalassemia had lighter anemia, later onset and later blood transfusion.

[KEY WORDS] thalassemia; gene diagnosis; clinical manifestation



地中海贫血(Thalassemia)是世界上最常见的血液遗传病之一，它好发于地中海沿岸、美国黑人人群和印度次大陆等地区，在我国南方(包括广东、广西、贵州、四川、湖北、湖南、福建、云南、海南、台湾等省) 发病率也很高[1]，是我国长江以南发病率最高、危害最大的一种遗传病，给社会和家庭带来沉重的负担。地贫在临床表现、血液学和生化检测指标方面呈现高度的异质性，重型地贫贫血严重，常依靠反复输血维持，往往未成年即已夭折。而轻型地贫可无临床症状，极易漏诊、误诊。地贫分子遗传流行病学资料显示，其基因突变类型和频率具有明显的地理和种族特异性[2]，近年来各地区有关报道较多。云南是一个少数民族聚居地区,由于基因检测技术条件不足，有关地中海贫血基因诊断方面的研究报道甚少,我们对78例高度疑诊为地中海贫血的患者用多重聚合酶链反应（PCR）、反向斑点杂交法（RDB）进行基因检测，分析基因突变类型与临床病情的关系,现报道如下。



1 资料与方法



1.1 研究对象

2003年5月至2006年6月在昆明市儿童医院血液科住院和门诊的患儿71例，其中男50例，女21例，年龄40天至11岁，平均年龄3.59岁。另外7例为患儿家长。血常规检查发现小细胞低色素性贫血，经网织红细胞计数、骨髓涂片、血清铁及铁蛋白、红细胞脆性试验等检查确诊为溶血性贫血，然后作血红蛋白(Hb)电泳分析，HbA2 、HbF 含量测定，如果红细胞脆性降低，而HbA2正常或降低，HbF正常者，在除外缺铁性贫血后考虑为静止型或标准型α地贫；如HbA2增高，伴或不伴HbF增高，则考虑为β地贫，进而对上述患儿进行α或β地贫基因检测。



1.2 方法

1. 2. 1 　标本采集　 采用无菌抗凝管(抗凝剂:EDTA-K2),抽取静脉血2ml混匀, 立即送检。标本采集前所有患儿均未在近期进行过输血治疗。

1. 2. 2 　双蒸水法提取DNA 取300ul抗凝全血加入1000ul双蒸水,充分混匀, 12000转/分, 离心5min；去上清液, 加入1000ul双蒸水,充分混匀,5000转/分, 离心5min；去上清液, 加入1000ul生理盐水, 充分混匀, 10000转/分, 离心10min；去上清液, 加入50ulDNA提取液充分混匀, 沸水浴10min；12000转/分, 离心5min,取5ul上清液点样上机。

1. 2. 3 地中海贫血基因检测 用多重PCR法（4对引物，见表1）结合琼脂糖凝胶电泳技术，反应条件:在PE 9600 PCR（美国）扩增仪上，94 ℃预变性1min，然后94 ℃30s，62 ℃1min，72 ℃3 min，共35个循环。取10μl PCR 扩增产物，进行(20 g/L) 琼脂糖凝胶电泳，20min后用UVP凝胶成像仪观察并记录结果。



结果判读：正常人的DNA 标本只产生一条1.8 kb带；α地中海贫血1杂合子(――SEA/) 出现1.8 kb和1.3kb两条带；α地中海贫血2 杂合子－4.2/出现1.8 kb和1.6 kb两条带,－3.7/出现2.0 kb和1.8 kb两条带；α地中海贫血1与α地中海贫血2双重杂合子(缺失型HbH 病):――SEA/－3.7出现2.0 kb 和1.3 kb 两条带,――SEA/ －4.2出现1.6 kb 和1.3kb 两条带；Hb Bart，s 水肿胎儿――SEA/ ――SEA只出现1.3kb一条带；α地中海贫血2双重杂合子－3.7/ －4.2出现2.0kb和1.6 kb 两条带；α地中海贫血2纯合子－4.2/ －4.2出现1.6 kb一条带,－3.7/－3.7出现2.0 kb一条带。



1. 2. 4 β地中海贫血基因检测 用PCR结合反向斑点杂交（RDB）技术，目的基因的扩增：四条引物以Bio-C1与Bio-C2、Bio-C3与Bio-C4、Bio-C1与Bio-C4（在5′端均用生物素标记，见表2）三种配对方式扩增突变的β珠蛋白基因，扩增片段大小分别为：602bp、423bp、1503bp。扩增产物进行反向斑点杂交、显色观察结果。实验分两个步骤进行。



1. 2. 4.1 PCR扩增 用PCR法扩增β珠蛋白基因转录启动区， ( 1)( 2) 引物扩增片段为602bp, (3)(4) 反应扩增片段为423bp , 1503bp, 其范围覆盖了中国人较为常见的29种β地贫点突变基因。反应条件同  地中海贫血基因检测，两者可同时进行扩增。

1. 2. 4.2 RDB 杂交膜条上结合的ASO 探针共16个,为常见的16种突变（见图1）



上排为正常（N）探针，中排为突变（M）探针，上中排对应的一对探针用于检测一种β-地贫突变，共8对探针，下排为“稀少”突变探针。结果判读：例如：①如在41-42N和M同时出现蓝色斑点，则说明被检者是41-42（-TCTT）杂合子，属于轻型β-地贫；②41-42N无斑点，仅M出现蓝色斑点，说明被检者是41-42（-TCTT）纯合子，属于重型β-地贫；③41-42N和M以及654N和M均出现斑点，说明被检者是41-42（-TCTT），IVS-Ⅱ654（C-T）双重杂合子，属于重型 β-地贫。



2 　结　果



2. 1 　临床检测结果　

78例疑诊患者经基因诊断确诊地中海贫血41例，其中男27例，女14例，傣族9例、彝族2例、布依族1例、壮族1例、汉族28例；HbF >3.1%者29例，最高者达87%；HbA2 > 3.3%者5例，最高者达38%；临床主要表现为贫血明显，中度和重度者36例(87.80%) ,轻度贫血者只有5例(12.20%)，网织红细胞计数增高，最高者达21%，腹部B超示肝、脾肿大明显，以脾大为主，脾肋下> 3 cm 者26例(63.41%)，最大达肋下9cm ，骨骼改变，有典型的地中海贫血面容者6例(14.63%) 。



2. 2　41例地贫患儿临床分型　

41例地中海贫血重型18例（43.90%）,包括HbH 病2例，β地贫纯合子9例、双重杂合子6例, α复合β地中海贫血1例；轻型地贫20例(48.78%)和中间型地贫3例（7.32%）。

2. 3　α地中海贫血基因检测结果　

α地中海贫血基因缺失型检测出3种类型5种组合，突变频率为14.63%(6/41) ,见表4。



2. 4 β地中海贫血基因检测结果　

β地中海贫血基因突变检测出6种类型11种组合，基因突变频率为82.93%(34/41) ,见表5。



2. 5 α复合β地中海贫血基因检测结果

α复合β地中海贫血1例，基因突变类型为17/17/α-4.2，基因突变频率为2.44% (1/41) ,临床表现为重型。



3 讨 论



地中海贫血属于常染色体显性遗传病，遗传基因是经过长期的对外文化和经济交流而传入我国,并成为我国南方最常见的血液遗传病之一。其分子生物学基础是珠蛋白基因缺陷导致珠蛋白肽链合成受到部分或完全抑制,造成肽链合成量比例失衡, 引起红细胞形态改变, 导致红细胞破坏加速，表现为红细胞体积较小和寿命缩短。若父母双方基因均正常,患儿的发病则由基因的新突变引起。通常根据珠蛋白链的种类将地贫分为α、β、γ、δβ等类型, 其中以α、β地贫最为常见，而β地贫危害最大。

地中海贫血的基因突变类型甚多，每个民族或群体可有其特定的基因突变型，对不同地区及民族进行地中海贫血研究为进一步探讨该病的分子机制、阐明人群迁移与疾病发生的关系以及尽可能的减少重症地贫婴儿的出生具有重要意义[3]。本组病例显示，本地区除汉族（68.29%）外，以傣族(21.95%)发病最高，此外还检出彝族（4.88%）、布依族（2.44%）及壮族（2.44%）发病的情况。本组结果显示，本地区的α地中海贫血基因突变类型主要是东南亚缺失型，占9.76%(4/41)，此结果与文献报道相符[4][5]，检出左侧缺失型(α-4.2)和右侧缺失型(α-3.7) α地贫，还检出HbH 病2例，但未检出非缺失型点突变HbCS和HbQS ,可能与本地区α地中海贫血发病率低以及本组检测病例数不多有关。

与α地贫相比，β地贫具有更多的突变型, 迄今为止世界范围已发现170 多种,我国已发现29种突变类型，最常见的突变依次为CD41-42、IVS-Ⅱ654、CD17、-28、CD71-72和-29[6]。本组34例β地中海贫血有6种基因突变类型11种组合依次为17/17、βE/N、654/N、17/βE、41-42/41-42、41-42/N、17/N、17/71-72、βE/41-42、17/41-42 、TATAbox-28/TATAbox-28。1例α复合β地中海贫血，基因突变类型为17/17/α-4.2，综合分析得出本地区β地贫基因点突变以17 (A→T)无义突变型最高，占45.71%（16/35），有别于相关文献报道[7] [8]，包括17位点纯合子占17.14%（6/35）、杂合子8.57% (3/35)以及双重杂合子20.0% (7/35)；排第二位的是βE位点突变型，占34.28% (12/35)，包括βE杂合子占17.14%(6/35）以及双重杂合子17.14%(6/35）；排第三位的是41-42 (-TTCT) 移码突变型，占22.86%(8/35)，包括41-42位点纯合子5.71%(2/35）、杂合子5.71% (2/35)以及双重杂合子11.43% (4/35)；排第四位的是IVS-Ⅱ654 (C→T) RNA 加工突变型，占14.28% (5/35)；还检出71-72位点突变占5.71% (2/35），TATAbox-28位点突变占2.86% (1/35)。本组基因检测结果显示：CD17、βE、CD41-42 、IVS-Ⅱ654，这4型为云南省β地中海贫血的主要类型，对我省开展遗传咨询、产前诊断奠定了基础，为以后进行云南地中海贫血方面的研究提供参考。

不同的基因突变类型致临床表现不同，查阅这41例患儿的临床资料结合基因检测结果分析：HbH 病2例，β地贫纯合子9例、双重杂合子6例，临床表现均较严重，发病较早(2 ～6 个月)，肝、脾肿大，尤其脾大明显，有3例达巨脾，重度贫血，Hb平均20－50g/l，HbF增高，波动于9.6%－87%，需靠反复输血维持生命。轻型地贫20例和中间型地贫3例，临床表现相对较轻，轻－中度贫血，Hb平均50－90g/l，发病年龄及输血年龄均较晚。广东和广西均报道过α和β地中海贫血复合存在的情况。本组确诊的41例中有1例为混合性地中海贫血,其基因突变频率为2.44% ,临床表现较重，2个月龄即发病，为重度贫血，脾肿大明显，查HbF 57%。在进行基因诊断时α地贫和β地贫两者应同时检测，尤其对于临床表现较重的患者，以免漏诊，这对降低重型地中海贫血患儿的出生率，提高人口素质具有重要意义。

我国少数民族人群中仍存在近亲通婚现象,本组41例病例中有3例患儿家长为表兄妹关系近亲通婚,患儿分别为β地贫-17、-28位点突变纯合子以及41-42位点突变杂合子, -17位点突变纯合子的患儿家长经基因检测证实夫妇双方均为-17位点突变杂合子,近亲结婚增加了近亲患病基因的发病风险。预防和减少地贫患儿的出生是一项艰巨而长期的任务, 重型β地贫的筛查诊断一直是遗传医学工作者的研究重点，对于已经确诊的地贫基因携带者, 建议进一步做好婚前检查、基因诊断、产前诊断等婚育保健工作。有效地早期防治地贫,有利于提高人群健康素质。



参考文献

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